¿Qué es la espectroscopía de fluorescencia?
Introducción a la espectroscopía de fluorescencia de estado estacionario y resuelto en tiempo
El término fluorescencia se refiere a un tipo de luminiscencia. La luminiscencia, ampliamente definida, es la emisión de luz de una molécula.
La fluorescencia, específicamente, es un tipo de fotoluminiscencia donde la luz eleva un electrón a un estado excitado. El estado excitado sufre una rápida pérdida de energía térmica para el medio ambiente a través de vibraciones, y luego se emite un fotón desde el estado excitado singlete más bajo. Este proceso de emisión de fotones compite por otros procesos no radiativos, incluida la transferencia de energía y la pérdida de calor.
Cuando se usa el término «fluorescencia», los mismos métodos de medición pueden aplicarse típicamente a cualquiera de las categorías de luminiscencia anteriores.
¿Qué es un espectro de fluorescencia?
Steady state fluorescence spectra are when molecules, excited by a constant source of light, emit fluorescence, and the emitted photons, or intensity, are detected as a function of wavelength. A fluorescence emission spectrum is when the excitation wavelength is fixed and the emission wavelength is scanned to get a plot of intensity vs. emission wavelength.
Un espectro de excitación de fluorescencia (azul) y un espectro de emisión (púrpura) son imágenes especulares entre sí
Un espectro de excitación de fluorescencia es cuando se fija la longitud de onda de emisión y se escanea la longitud de onda del monocromador de excitación. De esta manera, el espectro proporciona información sobre las longitudes de onda a las que una muestra absorberá para emitir en la longitud de onda de emisión única elegida para la observación. Es análogo al espectro de absorbancia, pero es una técnica mucho más sensible en términos de límites de detección y especificidad molecular. Los espectros de excitación son específicos de una sola longitud de onda emisora / especie en oposición a un espectro de absorbancia, que mide todas las especies absorbentes en una solución o muestra. Los espectros de emisión y excitación para un fluoróforo dado son imágenes especulares entre sí. Típicamente, el espectro de emisión ocurre a longitudes de onda más altas (energía más baja) que el espectro de excitación o absorbancia.
Estos dos tipos espectrales (emisión y excitación) se utilizan para ver cómo está cambiando una muestra. La intensidad espectral y / o la longitud de onda máxima pueden cambiar con variantes como la temperatura, la concentración o las interacciones con otras moléculas a su alrededor. Esto incluye moléculas de desactivación y moléculas o materiales que implican transferencia de energía. Algunos fluoróforos también son sensibles a las propiedades ambientales del disolvente, como el pH, la polaridad y ciertas concentraciones de iones.
¿Qué tipos de moléculas y materiales exhiben fluorescencia?
Fluorescent molecules and materials come in all shapes and sizes. Some are intrinsically fluorescent, such as chlorophyll and the amino acid residue tryptophan (Trp), phenylalanine (Phe) and tyrosine (Tyr). Others are molecules synthesized specifically as stable organic dyes or tags to be added to otherwise non-fluorescent systems. There are entire catalogs of these available. Typically, organic fluorescent molecules have aromatic rings and pi-conjugated electrons in them. Depending on their size and structure, organic dyes can emit from the UV out into the near-IR.
Espectros de emisión de fluorescencia de algunos fluoróforos comunes a través del espectro UV y visible
Aquí hay una muestra aleatoria de algunos fluoróforos comunes que abarcan el rango UV y visible. Algunos elementos de tierras raras, o lantánidos, tienen orbitales electrónicos más altos llenos, donde la transición de electrones debido a las transferencias de carga de ligandos metálicos ocurre entre los orbitales 4f-5d e incluso 4f-4f. (Bunzli, 1989) Hay muchas moléculas que son de naturaleza luminiscente, como algunos de los aminoácidos, clorofilas y pigmentos naturales. Otros están altamente diseñados para usos muy específicos de la espectroscopía de fluorescencia.
Algunas de las categorías de moléculas y materiales fluorescentes son:
- Aminoácidos (Trp, Phe, Tyr)
- Derivados de pares de bases (2-AP, 3-MI, 6-MI, 6-MAP, pirrolo-C, tC)
- Clorofilas
- Proteínas Fluorescentes (PF)
- Colorantes orgánicos (fluoresceína, rodamina, N-aminocoumarinas y derivados de estos)
- Elementos de tierras raras (lantánidos)
- Semiconductores
- Puntos cuánticos
- Nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT)
- Células solares
- Pigmentos, abrillantadores
- Fósforos
- Mucho mas…
Otras moléculas y materiales como proteínas fluorescentes, semiconductores, fósforos y elementos de tierras raras se encuentran entre las muestras fluorescentes de uso común. Los polímeros con compuestos aromáticos o dienos conjugados también tienen comúnmente propiedades fluorescentes. Por supuesto, se crean nuevos materiales todo el tiempo.
Características principales
- Relación señal / ruido Raman del agua: 16000:1 (6000:1 FSD)
- Conteo de fotones para máxima sensibilidad
- Capacidad de escaneo rápido: hasta 80 nm / segundo
- Potente software FluorEssence para Windows
- Archivos de método para recuperar parámetros completos del experimento
Hardware
La fuente
La fuente de xenón que proporciona un excelente rendimiento UV se enfoca en la ranura de entrada del monocromador de excitación con un espejo elíptico. Además de garantizar una recolección eficiente, la superficie reflectante mantiene todas las longitudes de onda enfocadas en la hendidura.
Como opción, se puede instalar una lámpara de flash de xenón adicional seleccionable por software para permitir los estudios de fosforescencia.
Las ranuras
Las ranuras en sí son ajustables de forma bilateral y continua desde la computadora en unidades de paso de banda o milímetros. Esto preserva la resolución máxima y la reproducibilidad instantánea.
El monocromador de excitación
El monocromador de excitación es un diseño asférico que garantiza que la imagen de la luz difractada por la rejilla se ajuste a través de la ranura. Las rejillas en sí son rejillas planas y flameadas que evitan las dos desventajas principales de las rejillas holográficas cóncavas más comunes: pobre rendimiento de polarización e imágenes inadecuadas durante los escaneos que arrojan la luz. La unidad de longitud de onda única escanea la rejilla a velocidades de hasta 80 nm / s. Las ranuras de rejilla se arden para proporcionar la máxima luz en la región UV y visible.
El detector de referencia
Antes de que la luz de excitación llegue a la muestra, un detector de referencia de fotodiodo controla la intensidad en función del tiempo y la longitud de onda. El detector de fotodiodos tiene una respuesta de longitud de onda más amplia que el contador cuántico de rodamina B tradicional más antiguo y no requiere mantenimiento.
La cámara de la muestra
Se proporciona una cámara de muestra espaciosa para permitir el uso de una larga lista de accesorios para muestras especiales, y alienta al usuario a utilizar una variedad de esquemas de muestra.
El monocromador de emisiones
Todas las características sobresalientes del monocromador de excitación también se incorporan al monocromador de emisión. Las rejillas se encienden para proporcionar el máximo rendimiento en la región visible.
El detector de emisiones
La electrónica del detector de emisiones emplea el conteo de fotones para lo último en detección de bajo nivel de luz. El recuento de fotones se concentra en las señales que se originan de la emisión de fluorescencia, ignorando las señales más pequeñas que se originan en el tubo detector (PMT). El método más común de detección analógica (utilizado por fluorómetros de bajo rendimiento) simplemente agrega ruido y señal, enmascarando emisiones débiles.
La carcasa del detector de emisiones también contiene un suministro integral de alto voltaje que viene configurado de fábrica para proporcionar la relación señal / ruido.
Control de la computadora
Todo el control de FluoroMax se origina en su PC con nuestro software FluorEssence™ y se transmite a través de un enlace USB. En el arranque, el sistema se calibra automáticamente y se presenta para nuevos experimentos o rutinas almacenadas llamadas instantáneamente desde la memoria.
Accesorios
Una amplia variedad de accesorios están orientados a aplicaciones y la mayoría son intercambiables con el sistema FluoroMax.
FluorEssence – Software de dominio de estado estable y frecuencia
FluorEssence – Software de dominio de estado estable y frecuencia
- Las ventanas simplificadas hacen que la adquisición de datos sea intuitiva incluso para el usuario casual.
- Con el álgebra de detectores, reúna señales de entrada de diferentes detectores en ecuaciones únicas (incluidas funciones aritméticas o trascendentales) que producen datos en un formato adaptado a su aplicación.
- Seleccione la ventana especial de Control en tiempo real (RTC) para optimizar sus parámetros de ejecución antes de escanear.
- Los videos tutoriales gratuitos hacen que FluorEssence ™ sea aún más fácil de aprender.
- Ejecute una variedad de accesorios que incluyen polarizadores, lectores de placas de micropocillos, baños de temperatura, autotitadores, fosforímetros y más.
- Corrección automática de blancos y salida de lámpara.
- Cambie las unidades de temperatura, longitud de onda y ancho de hendidura con el clic de un mouse.
- Accesorio de recuento de fotones individuales (TCSPC) correlacionado con el tiempo para determinaciones de por vida
- Accesorio de fosforímetro para determinaciones de luminiscencia de larga duración.
